High Resolution Melting Analysis (PCR-HRM – Polymerase Chain Reaction-High Resolution Melting) is a recently developed technique for fast, high-throughput post-PCR analysis of genetic mutations or variance in sequences of nucleic acid. It enables researchers to rapidly detect and categorize genetic mutations, identify new genetic variants without sequencing, or determine the genetic variation in a population prior to sequencing. PCR-HRM technique was also used to detect and distinguish Bursaphelenchus xylophilus from morphologically and genetically similar nematode species B. mucronatus. In the research reported here PCR-HRM was conducted on the rDNA of B. xylophilus (China) and Polish isolates of B. mucronatus (Mdz-01, Rad-03 and Wro-01), with the use of primers specifically designed from the ITS-1 region of B. mucronatus. The conducted study revealed that PCR-HRM is an effective essay which allows one to distinguish of B. xylophilus from B. mucronatus. This technique is very sensitive and enables detection of differences even in single nucleotides. PCR-HRM technique is also much cheaper when compared to commonly used PCR-RFLP.

Reakcję PCR-HRM (Polymerase Chain Reaction-High Resolution Melting) przeprowadzano z wykorzystaniem całkowitego DNA (deoxyribonucleic acid) Bursaphelenchus xylophilus [izolat China pochodzący z kolekcji Instytutu Juliusa Kühna – Federalnego Centrum Badań Roślin Uprawnych (Julius Kühn Institute Federal Research Centre for Cultivated Plants – JKI) w Braunschweig, Niemcy, a uzyskany na podstawie zezwolenia Ministerstwa Rolnictwa i Rozwoju Wsi na import dla celów badawczych] i polskich populacji B. mucronatus (izolaty Mdz-01, Rad-03 i Wro-01). W reakcji PCR wykorzystano startery komplementarne do rejonu oskrzydlającego fragment ITS-1 rDNA badanych gatunków. W projektowaniu starterów wykorzystano program IDT's PrimerQuest (wersja 2.2.3). Przeprowadzone doświadczenia potwierdziły wysoką skuteczność zaprojektowanych starterów do odróżniania kwarantannowego nicienia B. xylophilus od najbliżej spokrewnionego z nim B. mucronatus. Analiza krzywej topnienia produktów reakcji wykazała obecność pojedynczego produktu amplifikacji dla każdej z przeprowadzonych reakcji. Uzyskane podczas analizy HRM znormalizowane krzywe topnienia DNA różniły się pomiędzy sobą temperaturą denaturacji, o czym świadczą znaczne przesunięcia tych krzywych względem siebie. Wskazuje to na obecność różnic w składzie nukleotydowym badanych gatunków nicieni w powielanym rejonie genomu. Reakcja PCR-HRM umożliwia wykrycie nawet pojedynczych zmian nukleotydowych w badanych produktach PCR, dzięki czemu może być bardzo przydatną metodą wspomagającą i rozstrzygającą w przypadku identyfikacji bardzo blisko ze sobą spokrewnionych gatunków i izolatów dających niejednoznaczne rezultaty w reakcji real-time PCR. W porównaniu do innych metod molekularnych, technika PCR-HRM może być dużo prostszym i znacznie tańszym sposobem identyfikowania kwarantannowego szkodnika B. xylophilus.