Progress in Plant Protection

Influence of different methods of bacterial nucleic acid isolation on sensitivity of the PCR assay
Wpływ różnych sposobów izolacji kwasów nukleinowych z bakterii na czułość testu PCR  

Włodzimierz Przewodowski, e-mail: w.przewodowski@ihar.edu.pl

Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin - Państwowy Instytut Badawczy, Zakład Nasiennictwa i Ochrony Ziemniaka w Boninie, Bonin 3, 76-009 Bonin, Polska

Joanna Chołuj, e-mail: j.choluj@ihar.edu.pl

Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin - Państwowy Instytut Badawczy, Zakład Nasiennictwa i Ochrony Ziemniaka w Boninie, Bonin 3, 76-009 Bonin, Polska

Agnieszka Przewodowska, e-mail: a.przewodowska@ihar.edu.pl

Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin - Państwowy Instytut Badawczy, Zakład Nasiennictwa i Ochrony Ziemniaka w Boninie, Bonin 3, 76-009 Bonin, Polska
Abstract

Isolation of nucleic acids of different plant pathogens is one of the most important stages, which have influence on the correct molecular diagnosis of these pathogens. This study investigated the suitability of two different DNA isolation techniques used in the diagnosis of Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (Cms) – quarantine bacteria responsible for potato ring rot. The quality of the isolated DNA and the sensitivity of the two methods were assessed by spectrophotometric analysis, respectively/and the sensitivity of electrophoretic DNA PCR (polymerase chain reaction) assay. Two methods of DNA extraction were compared. The first of them with CTAB (cetyltrimethylammonium bromie) method allowed to remove the components of plant tissues and while destructing membranes released nucleic acids from bacterial cells (method 1). In the second method extraction of genomic DNA was done in the presence of high concentrations of salt, which involved the selective precipitation of nucleic acids (method 2). In addition to the efficiency of the compared extraction methods the impact of bacterial slime and buffer components on the quality of the obtained DNA were also assessed. It has been shown that the best quality of DNA and PCR sensitivity was obtained using the CTAB method. The high mucoid level of tested strains only marginally reduced the detection of bacteria Cms in PCR assay.

 

Izolacja kwasów nukleinowych patogenów roślin jest jednym z najważniejszych etapów warunkujących prawidłową diagnostykę molekularną tych patogenów. W pracy badano przydatność różnych technik izolacji DNA kwarantannowych bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (Cms) – sprawcy bakteriozy pierścieniowej ziemniaka, stosowanych w diagnostyce bakteryjnych patogenów ziemniaka. Jakość wyizolowanego DNA oraz czułość obu metod oceniano na podstawie odpowiednio analizy spektrofotometrycznej/elektroforetycznej DNA oraz czułości testu PCR (polymerase chain reaction – łańcuchowej reakcji polimerazy). Porównywano dwie różne metody izolacji DNA. Pierwsza z nich – metoda z wykorzystaniem CTAB (cetyltrimethylammonium bromie – bromek cetylotrimetyloamoniowy) umożliwia usunięcie komponentów tkanek roślinnych oraz destrukcję błon i uwolnienie kwasów nukleinowych z komórek bakterii (metoda 1). W drugiej z porównywanych metod ekstrakcję genomowego DNA przeprowadzano w obecności wysokiego stężenia soli powodującego selektywne wytrącanie kwasów nukleinowych (metoda 2). Oprócz efektywności metod ekstrakcji oceniano również wpływ śluzów bakteryjnych oraz komponentów buforów na jakość uzyskanych preparatów DNA. Wykazano, iż najlepszą jakość DNA i czułość testu PCR uzyskano stosując metodę CTAB, a wysoka mukoidalność badanych szczepów jedynie w nieznacznym stopniu obniżyła wykrywalność bakterii Cms testem PCR.

Key words
Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus; DNA isolation; PCR; CTAB; izolacja DNA  
References

Csaikl U.M., Bastian H., Brettschneider R., Gauch S., Meir A., Schauerte M., Scholz F., Sperisen C., Vornam B., Ziegenhagen B. 1998. Comparative analysis of different DNA extraction protocols: A fast, universal maxi-preparation of high quality plant DNA for genetic evaluation and phylogenetic studies. Plant Molecular Biology Reporter 16 (1): 69–86.

Dellaporta S.L., Wood J., Hicks J.B. 1983. A plant DNA mini-preparation: version 2. Plant Molecular Biology Reporter 1 (4): 19–21.

Doyle J.J., Doyle J.L. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin 19: 11–15.

Doyle J.J., Doyle J.L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12: 13–15.

Edwards K., Johnstone C., Thompson C. 1991. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Research 19, p. 1349.

Guillemaut P., Maréchal-Drouard L. 1992. Isolation of plant DNA: a fast, inexpensive, and reliable method. Plant Molecular Biology Reporter 10 (1): 60–65.

John M.E. 1992. An efficient method for isolation of RNA and DNA from plants containing polyphenolics. Nucleic Acid Research 20 (9), p. 2381.

Kotchoni S.O., Gachomo E.W., Betiku E., Shonukan O.O. 2003. A home made kit for plasmid DNA mini preparation. African Journal of Biotechnology 2 (4): 88–90.

Mak Y.M., Ho K.K. 1992. An improved method for the isolation of chromosomal DNA from various bacteria and cyanobacteria. Nucleic Acids Research 20 (15): 4101–4102.

OEPP/EPPO 2006. Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 36: 99–109.

Pastrik K.-H. 2000. Detection of Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of host DNA. European Journal of Plant Pathology 106: 155–165.

Pastrik K.-H., Maiss E. 2000. Detection of Ralstonia solanacearum in potato tubers by polymerase chain reaction. Journal of Phytopathology 148 (11–12): 619–626.

Porębski S., Bailey L.G., Baum B.R. 1997. Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components. Plant Molecular Biology Reporter 15 (1): 8–15.

Sharma A.D., Gill P.K., Singh P. 2002. DNA isolation from dry and fresh samples of polysaccharide-rich plants. Plant Molecular Biology Reporter 20 (4), p. 415.

Smith D.S., Maxwell P.W., De Boer S.H. 2005. Comparison of several methods for the extraction of DNA from potatoes and potato-derived products. Journal of Agricultural and Food Chemistry 53 (26): 9848–9859.

Wattier R.A., Prodohl P.A., Maggs C.A. 2000. DNA isolation protocol for red seaweed (Rhodophyta). Plant Molecular Biology Reporter 18 (3): 275–281.

Van Beckhoven J.R.C.M., Stead D.E., Van der Wolf J.M. 2002. Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus by AmpliDet RNA, a new technology based on real time monitoring of NASBA amplicons with a molecular Bacon. Journal of Applied Microbiology 93: 840–849.

Progress in Plant Protection (2015) 55: 321-326
First published on-line: 2015-05-07 10:04:49
http://dx.doi.org/10.14199/ppp-2015-056
Full text (.PDF) BibTeX Mendeley Back to list