Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Cms) bacterium is responsible for ring rot of potato, one of the most dangerous disease that affects potato plants and tubers. The best method to limit the disease propagation is quick and sensitive diagnostic of Cms bacteria. The deciding factor for the effectiveness of the immunologic tests is the quality of antibodies that detect the pathogen. In order to examine the influence of isolation of the antibodies aimed at entire bacterium cells (Cms) on their quality, two different methods of ion-exchange chromatography allowing isolation of IgG from rabbit blood serum were assessed. Separations were performed in columns filled with DEAE cellulose (diethylaminoethyl cellulose) and thiophilic Sepharose beds respectively. The stage that preceded chromatographic separations in both methods comprised an initial purification by precipitation of proteins from the serum in presence of salt solution. Using both matrices a preparative isolation of antibodies and removal of other impurities were achieved. The applied methods were compared in terms of quality of the antibodies obtained as well as time and difficulty of their accomplishment. Sensitivity of the antibodies to detect Cms bacteria was examined by application of DAS-ELISA assay (double-antibody sandwich enzyme linked immunosorbent assay).

Bakteria Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Cms) jest sprawcą bakteriozy pierścieniowej ziemniaka, jednej z naj-groźniejszych chorób tej rośliny. Najlepszym sposobem ograniczenia rozprzestrzeniania się tej choroby jest szybka i czuła diagnostyka bakterii Cms. W testach immunologicznych czynnikiem decydującym o skuteczności prowadzonej diagnostyki jest jakość przeciwciał wykrywających danego patogena. W celu zbadania wpływu sposobu izolacji przeciwciał skierowanych na całe komórki bakterii (Cms), na ich jakość, oceniano dwie różne metody chromatografii jonowymiennej pozwalające na izolację immunoglobuliny G (IgG) z surowicy krwi króliczej. Rozdziały prowadzono w kolumnach wypełnionych odpowiednio złożem z DEAE-celulozy (diethylaminoethyl cellulose – dietyloaminoetylo-celulozy) oraz złożem z sefarozy tiofilnej. Etapem poprzedzającym rozdziały chromatograficzne w obu metodach było oczyszczanie wstępne przez strącanie białek z surowicy w obecności stężonego roztworu soli. Przy wykorzystaniu obu matryc uzyskano preparatywną izolację przeciwciał oraz usunięcie pozostałych zanieczyszczeń. Stosowane metody porównywano pod kątem jakości otrzymywanych przeciwciał oraz czasu i trudności wykonania. Czułość uzyskanych przeciwciał w wykrywaniu bakterii Cms oceniano testem DAS-ELISA (double-antibody sandwich enzyme linked immunosorbent assay – test immunoenzymatyczny z podwój-nym wiązaniem przeciwciał).

Barnyk A., Lewosz J., Treder K., Przewodowski W., Pilecki T. 2008. Zastosowanie chromatografii tiofilnej do izolacji przeciwciał poliklonalnych z surowicy krwi królików. Biuletyn Instytutu Hodowli i Aklimatyzacji Roślin 248: 87–95.

De Boer S.H., Copeman R.J. 1980. Bacterial ring rot testing with the indirect fluorescent antibody staining procedure. American Journal of Potato Research 57: 457–465.

De Boer S.H., Charkowski A.O., Zink R.T., Martinez-Soriano J.P., Flores-Olivas A. 2005. Procedure for detection and identification of Clavibcter michiganensis subsp. sepedonicus (Spieckermann and Kotthoff) Davis, Gillaspie, Vidaver and Harris, in potato (Solanum tuberosum L.) tubers. Revista Mexicana de Fitopatologia 23: 329–334.

Hebert G.A., Pelham P.L., Pittman B. 1973. Determination of the optimal ammonium sulfate concentration for the fractionation of rabbit, sheep, horse and goat antisera. Journal of Applied Microbiology 25: 26–36.

OEPP/EPPO 2006. Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 36: 99–109.

Przewodowski W., Barnyk A. 2009. Szybki test do identyfikacji bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. [Rapid test for identification of Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus]. Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 49 (2): 696–700.

Przewodowski W. 2009. Szybki immunologiczny test do identyfikacji bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Konferencja naukowo-szkoleniowa „Nasiennictwo i ochrona ziemniaka”. IHAR, ZNiOZ Bonin. Darłówko, 21–22.05.2009, 78 ss.

Slack S.A., Sanford H.A., Manzer F.E. 1979. The latex agglutination test as rapid serological assay for Corynabacterium sepedonicum. American Journal of Potato Research 56: 441–446.

Van Beuningen A.R., Derks H., Janse J.D. 1995. Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus with special attention to fluorescent in situ hybridization (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe. Züchtungs Forschung 1 (2): 266–269.

Whitaker J.R., Granum P.E. 1980. An absolute method for protein determination based on difference in absorbance at 235 and 280 nm. Analytical Biochemistry 109: 156–159.

Yang Y.B., Harrison K. 1996. Influence of column type and chromatographic conditions on the ion-exchange chromatography of immunoglobulins. Journal of Chromatography A 743 (1): 171–180.