Progress in Plant Protection

The use of real-time polymerase chain reaction with high resolution melting (real-time PCR-HRM) analysis for the detection and identification of pathogenetic and nonpathogenetic populations
of the quarantine nematode Bursaphelenchus xylophilus
Wykorzystanie techniki real-time PCR-HRM do wykrywania i odróżniania patogenicznych i niepatogenicznych populacji kwarantannowego gatunku nicienia Bursaphelenchus xylophilus 

Anna Filipiak, e-mail: a.filipiak@iorpib.poznan.pl

Instytut Ochrony Roślin – Państwowy Instytut Badawczy, Władysława Węgorka 20, 60-318 Poznań, Polska
Streszczenie

The quarantine nematode Bursaphelenchus xylophilus (pine wood nematode, PWN) is the causal agent of pine wilt disease in Asia and Europe. Great variation has been reported in the virulence level among populations of B. xylophilus. It is difficult to distinguish nematodes differing in virulence based on their morphology, therefore molecular biological techniques have been developed to identify virulence of various B. xylophilus populations. The real-time PCR-HRM was developed and evaluated as a method to detect and distinguish virulent and avirulent populations of B. xylophilus. A set of primers was designed to target the ITS-2 region of rDNA. Reliability of the newly developed primer pair was examined and positively verified on eight virulent and two avirulent isolates of B. xylophilus originating from geographically distant localities in Europe and Asia. The results showed two distinct melting curve profiles related to each of the examined virulent forms. The results have demonstrated that the real-time PCR-HRM analysis is a rapid, simple and accurate method to detect and distinguish virulent and avirulent populations of B. xylophilus.


Bursaphelenchus xylophilus jest czynnikiem sprawczym choroby więdnięcia sosny, doprowadzającym do zamierania drzew sosnowych na kontynencie azjatyckim, a od 1999 roku również w Europie. Dotychczasowe badania prowadzone nad patogenicznością nicienia B. xylophilus wykazały, że nie wszystkie izolaty tego szkodnika doprowadzają do zamierania drzew. W obrębie jego populacji stwierdzono występowanie patogenicznych, jak i całkowicie niepatogenicznych jego izolatów. Morfologiczne odróżnienie poszczególnych populacji charakteryzujących się różną patogenicznością jest całkowicie niemożliwe, dlatego poszukiwane są metody molekularne umożliwiające jak najbardziej precyzyjne ich odróżnienie. W przeprowadzonych badaniach do odróżniania pato-genicznych i niepatogenicznych populacji tego kwarantannowego nicienia wykorzystano reakcję real-time PCR-HRM. W badaniach wykorzystano całkowite DNA patogenicznych oraz niepatogenicznych populacji B. xylophilus pochodzących z różnych rejonów świata. Dla populacji tych zaprojektowano własne startery, które amplifikowały fragment regionu ITS-2 rDNA. Przeprowadzone doświadczenia potwierdziły wysoką skuteczność zaprojektowanych starterów do odróżniania patogenicznych i niepatogenicznych populacji kwarantannowego nicienia B. xylophilus.


Słowa kluczowe
Bursaphelenchus xylophilus; nematode virulence; real-time PCR-HRM; pine wilt disease; quarantine nematode; detection; wirulencja; choroba więdnięcia sosny; nicień kwarantannowy; wykrywanie
Referencje

Aikawa T., Kikuchi T. 2007. Estimation of virulence of Bursaphelenchus xylophilus (Nematoda: Aphelenchoididae) based on its reproductive ability. Nematology 9 (3): 371–377. DOI: 10.1163/156854107781352007.

 

Braasch H., Burgermeister W., Pastrik K. 1995. Differentiation of three Bursaphelenchus species by means of RAPD-PCR. Nachrichtenblatt des Deutschen Pflanzenschutzdiensts 47: 310–314.

 

Braasch H., Tomiczek Ch., Metge K., Hoyer U., Burgermeister W., Wulfert I., Schönfeld U. 2001. Records of Bursaphelenchus spp. (Nematoda, Parasitaphelenchidae) in coniferous timber imported from the Asian part of Russia. Forest Pathology 31: 129–140. DOI: 10.1046/j.1439-0329.2001.00233.x.

 

Demeler J., Ramünke S., Wolken S., Ianiello D., Rinaldi L., Gahutu J.B., Cringoli G., von Samson-Himmelstjerna G., Krücken J. 2013. Discrimination of gastrointestinal nematode eggs from crude fecal egg preparations by inhibitor-resistant conventional and real-time PCR. PLoS ONE 8(4): e61285. DOI: 10.1371/journal.pone.0061285.

 

Filipiak A., Hasiów-Jaroszewska B. 2016. The use of real-time polymerase chain reaction with high resolution melting (real-time PCR-HRM) analysis for the detection and discrimination of the quarantine nematode Bursaphelenchus xylophilus and Bursaphelenchus mucronatus. Molecular and Cellular Probes 30 (2): 113–117. DOI: 10.1016/j.mcp.2016.02.003.

 

Fonseca L., dos Santos M.C.V., Santos M.S.N.A., Curtis R.H.C., Abrantes I.M.O. 2008. Morphobiometrical characterisation of Portuguese Bursaphelenchus xylophilus isolates with mucronate, digitate or round tailed females. Phytopathologia Mediterranea 47: 223–233.

 

Gu J., Wang J., Braasch H., Burgermeister W., Schroeder T. 2011. Morphological and molecular characterisation of mucronate isolates ('M' form) of Bursaphelenchus xylophilus (Nematoda: Aphelenchoididae). Russian Journal of Nematology 19: 103–120.

 

Holterman M.H.M., Oggenfuss M., Frey J.E., Kiewnick S. 2012. Evaluation of high-resolutionmelting curve analysis as a new tool for root-knot nematode diagnostics. Journal of Phytopathology 160: 59–66.

 

Irdani T., Caroppo S., Ambrogioni L. 1995. Molecular identification of pine wood Bursaphelenchus species. Nematologia Mediterranea 23: 99–106.

 

Kiyohara T., Bolla R.I. 1990. Pathogenic variability among populations of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Forest Science 36 (4): 1061–1076.

 

Koressaar T., Remm M. 2007. Enhancements and modifications of primer design program Primer3. Bioinformatics 23 (10): 1289–1291.

 

Mota M.M., Braasch H., Bravo M.A., Penas A.C., Burgermeister W., Metge K., Sousa E. 1999. First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe. Nematology 1 (7–8): 727–734.

 

Panichareon B., Khawsak P., Deesukon W., Sukhumsirichart W. 2011. Multiplex real-time PCR and high-resolution melting analysis for detection of White spotsyndrome virus, Yellow-head virus, and Penaeus monodon densovirus in penaeidshrimp. Journal of Virological Methods 178 (1–2): 16–21. DOI: 10.1016/j.jviromet.2011.07.010.

 

Pasay C., Arlian L., Morgan M., Vyszenski-Moher D., Rose A., Holt D., Walton S., McCarthy J. 2008. High-resolution melt analysis for the detection of a mutation associated with permethrin resistance in a population of scabies mites. Medical and Veterinary Entomology 22 (1): 82–88. DOI: 10.1111/j.1365-2915.2008.00716.x.

 

Penas A.C., Correia P., Bravo M.A., Mota M., Tenreiro R. 2004. Species of Bursaphelenchus Fuchs, 1937 (Nematoda: Parasitaphelenchidae) associated with maritime pine in Portugal. Nematology 6 (3): 437–453.

 

Robertson L., Cobacho Arcos S., Escuer M., Santiago Merino R., Esparrago G., Abelleira A., Navas A. 2011. Incidence of the pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus Steiner & Buhrer, 1934 (Nickle, 1970) in Spain. Nematology 13 (6): 755–757.

 

Senapin S., Molthathong S., Phiwasaiya K., Jaengsanong C., Chuchird N. 2010. Application of high resolution melt (HRM) analysis for duplex detection of Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and extra small virus (XSV) in shrimp. Molecular and Cellular Probes 24 (5): 291–297.

 

Untergasser A., Cutcutache I., Koressaar T., Ye J., Faircloth B.C., Remm M., Rozen S.G. 2012. Primer3 – new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research 40 (15): e115. DOI: 10.1093/nar/gks596.

 

Vieira P., Burgermeister W., Mota M., Metge K., Silva G. 2007. Lack of genetic variation of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal revealed by RAPD-PCR analyses. Journal of Nematology 39 (2): 118–126.

 

Wang Y., Yamada T., Sakaue D., Suzuki K. 2005. Variations on the life history parameters and their influence on rate of population increase of different pathogenic isolates of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Nematology 7 (3): 459–467.

 

Wittwer C.T., Reed G.H., Hundry C.N., Vandersteen J.G., Pryor R.J. 2003. High-resolution genotyping by amplicons melting analysis using LC green. Clinical Chemistry 49 (6): 853–860.

 

Zhang L., Kong F., Yang B. 2002. Intra and interspecific variation in Bursaphelenchus xylophilus and B. mucronatus revealed by mtDNA polymorphism. Forest Research 15: 7–12.

Progress in Plant Protection (2017) : 0-0
Data pierwszej publikacji on-line: 2017-09-27 12:47:41
http://dx.doi.org/10.14199/ppp-2017-034
Pełny tekst (.PDF) BibTeX Mendeley Powrót do listy