Metoda kropelkowo-cyfrowego PCR należy do technologii amplifikacji kwasów nukleinowych trzeciej generacji, znajdując coraz częściej zastosowanie w diagnostyce fitopatogenów m.in. bakterii, nicieni, grzybów oraz wirusów. Ze względu na wysoką czułość, precyzję oraz brak konieczności stosowania krzywych standardowych i/lub genów referencyjnych stanowi doskonałą alternatywę dla łańcuchowej reakcji polimerazy PCR w czasie rzeczywistym. Niniejsza praca przedstawia możliwość zastosowania techniki odwrotnej transkrypcji i ddPCR (RT-ddPCR) do detekcji wirusa nekrozy pomidora (ToTV) w mączliku szklarniowym (Trialeurodes vaporariorum), który stanowi realne źródło zagrożenia dla upraw pomidora, szczególnie w krajach Europy południowej, gdzie obserwowane jest nasilone występowanie tego wirusa. Przeprowadzona na matrycy cDNA ocena ilości kopii wirusowego RNA w pojedynczym dorosłym osobniku mączlika szklarniowego wykazała, że może on nieść od 220 do nawet 8600 kopii badanego genu wirusa. Ze względu na brak skutecznych środków przeciwwirusowych, nowoczesne i szybkie techniki detekcji wirusów w roślinach, czy ich wektorach, są istotą walki z rozprzestrzenianiem chorób wirusowych. Opracowany protokół RT-ddPCR do detekcji ToTV w mączlikach może stanowić skuteczne narzędzie do monitorowania realnego zagrożenia chorobą pomidorów określaną przez hiszpańskich farmerów mianem „torrao”.

The technology of droplet digital PCR is considered to be third-generation technology of nucleic acid amplification recently developed for the diagnostics of phytopathogens, such as bacteria, nematodes, fungi and viruses. Due to its high sensitivity, precision and no need to use standard curves and/or reference genes it is an alternative to a real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). This paper presents the possibility of using the reverse transcription technique followed by ddPCR (RT-ddPCR) to detect tomato torrado virus, ToTV in the greenhouse whitefly (Trialeurodes vaporariorum), which is a real source of ToTV in tomato cultivation, especially in southern European countries, where it’s increased occurrence has been observed. The analysis of cDNA template evaluation of the virus RNA copies in a single adult greenhouse whitefly showed that it could carry from 220 to even 8600 copies of the virus gene. Due to the lack of effective antiviral agents, innovative and rapid viruses diagnostic assays are the essence of the fight against development of viral diseases. Therfore reported here RT-ddPCR protocol for the detection of ToTV in whiteflies may be an effective tool for monitoring the real threat of the tomato disease described by Spanish farmers as ”torrao”.

Alfaro-Fernández A., Córdoba-Sellés C., Cebrián M.C., Herrera-Vásquez J.A., Sánchez-Navarro J.A., Juárez M., Jordá C. 2008. First report of Tomato torrado virus on weed hosts in Spain. Plant Disease 92 (5): 831. DOI: 10.1094/PDIS-92-5-0831B

Alfaro‐Fernández A., Córdoba‐Sellés M.D.C., Juárez M., Herrera‐Vásquez J., Sánchez‐Navarro J., Cebrián M.D.C., Jordá C. 2010. Occurrence and geographical distribution of the ‘Torrado’ disease in Spain. Journal of Phytopathology 158 (7–8): 457–469. DOI: 10.1111/j.1439-0434.2009.01639.x

Budziszewska M., Frąckowiak P., Obrępalska-Stęplowska A. 2021. Analysis of the role of Bradysia impatiens (Diptera: Sciaridae) as a vector transmitting peanut stunt virus on the model plant Nicotiana benthamiana. Cells 10 (6): 1546. DOI: 10.3390/cells10061546

Budziszewska M., Obrępalska-Stęplowska A., Wieczorek P., Pospieszny H. 2008. The nucleotide sequence of a Polish isolate of Tomato torrado virus. Virus Genes 37 (3): 400–406. DOI: 10.1007/s11262-008-0284-3

Budziszewska M., Wieczorek P., Obrępalska-Stęplowska A. 2016. One-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for detection of tomato torrado virus. Archives of Virology 161: 1359–1364. DOI: 10.1007/s00705-016-2774-2

Budziszewska M., Wieczorek P., Zhang Y., Frishman D., Obrępalska-Stęplowska A. 2014. Genetic variability within the polish tomato torrado virus Kra isolate caused by deletions in the 3′-untranslated region of genomic RNA1. Virus Research 185: 47–52. DOI: 10.1016/j.virusres.2014.03.008

DeBlasio S.L., Rebelo A.R., Parks K., Gray S., Cilia M. 2018. Disruption of chloroplast function through downregulation of phytoene desaturase enhances the systemic accumulation of an aphid-borne, phloem-restricted virus. Molecular Plant-Microbe Interactions 31 (10): 1095–1110. DOI: 10.1094/MPMI-03-18-0057-R

Ghoshal K., Theilmann J., Reade R., Maghodia A., Rochon D.A. 2015. Encapsidation of host RNAs by cucumber necrosis virus coat protein both during agroinfiltration and infection. Journal of Virology 89 (21): 10748–10761. DOI: 10.1128/JVI.01466-15

Herrera-Vásquez J.A., Rubio L., Alfaro-Fernández A., Debreczeni D.E., Font-San-Ambrosio I., Falk B.W., Ferriol I. 2015. Detection and absolute quantitation of Tomato torrado virus (ToTV) by real time RT-PCR. Journal of Virological Methods 221: 90–94. DOI: 10.1016/j.jviromet.2015.04.029

Mehle N., Dobnik D., Ravnikar M., Novak M.P. 2018. Validated reverse transcription droplet digital PCR serves as a higher order method for absolute quantification of Potato virus Y strains. Analytical and Bioanalytical Chemistry 410 (16): 3815–3825. DOI: 10.1007/s00216-018-1053-3

Pandey B., Mallik I., Gudmestad N.C. 2020. Development and application of a real-time reverse-transcription PCR and droplet digital PCR assays for the direct detection of Potato mop top virus in soil. Phytopathology 110 (1): 58–67. DOI: 10.1094/PHYTO-05-19-0185-FI

Pinheiro P.V., Ghanim M., Alexander M., Rebelo A.R., Santos R.S., Orsburn B.C., Gray S., Cilia M. 2017. Host plants indirectly influence plant virus transmission by altering gut cysteine protease activity of aphid vectors. Molecular & Cellular Proteomics 16 (4): S230–S243. DOI: 10.1074/mcp.M116.063495

Pospieszny H., Borodynko N., Obrępalska-Stęplowska A., Hasiów B. 2007. The first report of Tomato torrado virus in Poland. Plant Disease 91 (10): 1364. DOI: 10.1094/PDIS-91-10-1364A

Pospieszny H., Budziszewska M., Hasiów B., Obrępalska-Stęplowska A., Borodynko N. 2008. Wirus nekrozy pomidora (Tomato torrado virus) nowy wirus przenoszony przez mączlika szklarniowego (Trialeurodes vaporariorum). [Tomato torrado virus a new virus transmitted by greenhouse whitefly (Trialeurodes vaporariorum) in Poland]. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych 529: 139–147.

Pospieszny H., Budziszewska M., Hasiów‐Jaroszewska B., Obrępalska‐Stęplowska A., Borodynko N. 2010. Biological and molecular characterization of Polish isolates of Tomato torrado virus. Journal of Phytopathology 158 (1): 56–62. DOI: 10.1111/j.1439-0434.2009.01563.x

Pospieszny H., Hasiów-Jaroszewska B., Rymelska N., Borodynko N. 2012. Zastosowanie techniki IC real-time RT-PCR do wykrywania wirusa nekrozy pomidora (ToTV) w siewkach z porażonych nasion. [Using the IC real-time RT-PCR technique for the detection of tomato torrado virus (ToTV) in tomato seedling from infected seeds]. Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 52 (3): 515–517. DOI: 10.14199/ppp-2012-090

van der Vlugt R.A., Verbeek M., Dullemans A.M., Wintermantel W.M., Cuellar W.J., Fox A., Thompson J.R. 2015. Torradoviruses. Annual Review of Phytopathology 53: 485–512. DOI: 10.1146/annurev-phyto-080614-120021

Verbeek M., Dullemans A.M., Van den Heuvel J.F.J.M., Maris P.C., Van der Vlugt R.A.A. 2007. Identification and characterisation of tomato torrado virus, a new plant picorna-like virus from tomato. Archives of Virology 152 (5): 881. DOI: 10.1007/s00705-006-0917-6

Verbeek M., Tang J., Ward L.I. 2012. Two generic PCR primer sets for the detection of members of the genus Torradovirus. Journal of Virological Methods 185 (2): 184–188. DOI: 10.1016/j.jviromet.2012.06.020

Verbeek M., van Bekkum P.J., Dullemans A.M., van der Vlugt R.A. 2014. Torradoviruses are transmitted in a semi-persistent and stylet-borne manner by three whitefly vectors. Virus Research 186: 55–60. DOI: 10.1016/j.virusres.2013.12.003

Wieczorek P., Obrępalska-Stęplowska A. 2013. Multiplex RT-PCR reaction for simultaneous detection of Tomato torrado virus and Pepino mosaic virus co-infecting Solanum lycopersicum. Journal of Plant Protection Research 53 (3): 289–294. DOI: 10.2478/jppr-2013-0043

Zhang Y., Huang J., Wang X., Zhou H., Li X., Fu W., Zhu P., Wang C. 2017. Detection of Potato virus S (PVS) by droplet digital PCR (ddPCR). Journal of Agricultural Biotechnology 25 (10): 1721–1728. DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2017.10.019